本发明公开了一种微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值的确定方法：分别添加两种δ¹³C值差值悬殊的碳酸氢钠到附加10mM乙酰唑胺的检测培养液中来培养待测微藻；获得在两种同位素标记的检测培养液培养的被考察微藻的新生藻体稳定碳同位素组成以及待测微藻利用添加的无机碳源的份额；依据上述结果以及培养期间培养环境中大气二氧化碳的平均稳定碳同位素组成获取待测微藻二氧化碳同化过程中的稳定碳同位素分馏值。本发明能在体确定稳定碳同位素分馏值，不仅能测得单个微藻种的稳定碳同位素分馏值，而且也能测定混合藻的稳定碳同位素分馏值，测得的数据可靠，结果精度高。